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粪便中寄生虫卵的定量方法与流程

时间:2021-10-09 18:07 来源:网络整理 转载:ecc2016资讯网
本申请要求2014年10月3日提交的****临时专利申请No.62/059,262和2014年4月10日提交的****临时专利申请系列No.61/977,754的权益。 技术领域 本发明涉及动物寄生虫载量的诊断,并且更特别地涉及定量粪便中寄生虫卵数量的方法。 背景 甚至在最乐观的情况下,

粪便中寄生虫卵的定量方法与流程


本申请要求2014年10月3日提交的****临时专利申请No.62/059,262和2014年4月10日提交的****临时专利申请系列No.61/977,754的权益。

技术领域

本发明涉及动物寄生虫载量的诊断,并且更特别地涉及定量粪便中寄生虫卵数量的方法。

背景

甚至在最乐观的情况下,预计全球人口也计划持续大幅增长至21世纪(UN,2004),对单独的肉类生产的需求在1999至2050年之间翻倍(Steinfeld等,2006)。满足这种需求的一个主要障碍是内蠕虫寄生虫对动物的感染,所述蠕虫寄生虫基本上普遍存在于全球所有农场动物中。

蠕虫寄生虫是蠕虫样动物的多源群,包括分类群绦虫类(cestodes)、线虫类(nematodes)、吸虫类(trematodes)和单殖吸虫类(monogeneans)。许多蠕虫寄生虫通过消化系统,首先通过摄入被寄生虫或其卵污染的物质来****。在其生命周期过程中,这样的寄生虫可以移动至身体的其他部分,且返回消化道产更多的卵,其随后在粪便中被排泄,以****新感染的来源。

蠕虫感染引起动物,包括人类中相当高的发病率,并且在农业牲畜的情况中,由于降低的增重、产奶和繁殖引起的降低的生产力,导致实质性的经济损失。尽管严重的感染会导致死亡,但是携带内寄生虫的反刍动物,即使在亚临床水平下,通过各种形式-包括贫血、降低的繁殖适度和哺乳期以及食物利用的降低-呈现显著的生产力损失,导致降低的生长和差的身体状况(Piedrafita等,2010;Perry和Randolph,1999;Hoglund等,2001;Reinhardt等,2006)。在****,牲畜生产力的年损失估算每年为三十亿美元(Bagley等,2014)。在发展****家-在那里兽医护理、驱虫药和系统化的抗蠕虫农场策略较少利用或较少广泛实施,并且在那里食物存储更有可能并且更严重-预期损失实质上更大。在农业上重要的非反刍动物,包括家禽(Permin等,1999)和猪(Nansen和Roepstorff,1999)中,以及其他经济上重要的食草动物中,如马(Duncan,1985)中,蠕虫感染也是个问题。在马的情况中,寄生虫感染还会导致动物身体活动能力的降低。然而,内寄生虫感染不限于农业牲畜,并且对于陪伴安慰动物,如猫和狗也是个问题。猫和狗的感染会导致称为人畜共患传染病的现象,导致最常感染幼儿的钩虫和蛔虫31。

寄生蠕虫感染在人类中也是广泛分布的。例如,旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)引起人的盘尾丝虫病(也称为河盲症)。据报道全世界约17至25百万人受到了旋盘尾丝虫的感染,大约一百万人失去了一定程度的视力。Brugia filariids可以感染人和其他动物,引起包括丝虫病(包括淋巴丝虫病)、象皮病和热带嗜酸粒细胞增多症的疾病。血吸虫病是由血吸虫属种的血吸虫引起的人的血管寄生虫病。血吸虫病是感染超过全世界十亿人的许多蠕虫病之一。这些疾病包括蛔虫病、鞭虫病、蛲虫病、丝虫病、旋毛虫病、盘尾丝虫病、片吸虫病和囊虫病。作为由于寄生虫引起的发病率和患病的主要诱因,血吸虫病仅次于疟疾,位列第二。

综合以上问题,对常用驱虫药的抗性(抗蠕虫抗性)是全球性的并且是牲畜生产中与日俱增的问题(Kaplan,2004)。多药抗性是绵羊和山羊操作中的常见现象(da Cruz等,2010),报道了全部抗蠕虫失败的几个情况(Cezar等,2010;Howell等,2008)。相似地,已经证明了马寄生虫对目前市场上可用的所有类别的驱虫药是抗性的并且绝大部分的马操作面临对至少一种药物的抗性(Peregrine等,2014)。最近,已经发现了牛寄生虫对几类常用的抗蠕虫产品的抗性逐渐提高(Gasbarre等,2009;Waghorn等,2006;Jackson等,2006)。

此外,这种抗性似乎以显著快于新的驱虫药产品研发和推出的速率在发展:****从20世纪80年代早期开始,就没有推出过新的抗蠕虫药类别用于大型动物。出于这些原因,世界兽医组织正促进对作为动物护理关键方面的寄生虫感染和药物抗性存在的****(Wood等,1995)。

在兽医领域中,有时候通过呈现的临床症状来诊断蠕虫感染。兽医寄生虫学实践中的首要工具是粪便卵计数(FEC),这保持相对不变了几乎一个世纪4,11,并且通常,依赖于密度大于卵自身的糖和/或盐介质中的卵漂浮,接着通过显微镜检查和人工计数。目前使用的有两种FEC方法。

第一种并且可能是最普遍使用的卵计数程序是McMaster载玻片计数法,最初由Gordon和Whitlock在1939年用绵羊粪便研发出来的。在这种方法中,将粪便物质悬浮于密度大于寄生虫卵自身的糖和/或盐(SS)溶液中,并且放置在特别针对该目的****的显微镜载玻片中(McMaster载玻片计数法)。卵漂浮至表面(由此将其与密度更大的粪便残渣分离,以有助于观察)并且通过受过训练的个体使用40-100×放大倍数的显微镜进行人工计数。

第二种通常使用的卵计数程序是Wisconsin方法及其衍生方法。对于这些方法,通常在离心力的影响下,但也可以通过重力,直接将卵漂浮在放置在漂浮介质的表面弯月面上的盖玻片上。可以通过取样更多的粪便悬浮液,通过将其放入试管中形成弯月面来提高灵敏度。用盖玻片盖在弯月面上,并随后接受水平转子中的离心(Rossanigo和Gruner,1991;Egwang和Slocombe,1981)。然后如前通过显微镜计数粘附于盖玻片上的卵。

尽管McMaster-型测定操作比较简单,但涉及的高稀释度和小的取样导致测定与Wisconsin型测试相比具有较高的可变性和较低的灵敏度。相反,由于由离心力场产生的提高的漂浮以及它们允许的较大的样品体积,Wisconsin测试回收更多的卵,但技术上的要求略多并且需要获得离心机,这对于许多兽医实践在和在该领域中是不可行的。

不幸地,这两种技术不仅耗时,而且需要使用专门的实验室设备(即,显微镜,使用或不用离心机),这对于现场的兽医是很少可利用的,对于动物的主人更少。此外,大部分动物的主人不具有所需的训练来可靠地检验这样的样品(例如,外行可能容易将卵与其他粪便颗粒(如花粉颗粒)混淆)。通常,收集样品并送至兽医办公室用于分析或送至第三方分析实验室,导致增加的成本和/或诊断时间的延误。或者,动物的主人可以通过各种商业****将粪便直接运送至实验室,但通常需要等待48小时出结果。这,结合测试的耗时性质以及处理和检查每个样品的受训人员的需求,以及伴随的对成本的影响,导致较少动物的主人针对寄生虫的存在和抗性的产生定期测试他们的牲畜。

除了时间和设备问题之外,目前的卵计数方法还会遇到各种技术缺陷。例如,卵技术可变性限制了目前的卵技术方法的有效性。已经估算马卵计数在重复计数之间的差异为+/-50%(部分是由于主观的分析间可变性,而部分是因为由于小的取样体积引起的统计学原因)。因此,粪便卵计数降低中的真实变化和偶然可变性之间的描绘确实是个挑战(Vidyashankar等,2012)。尽管可以通过更好的分析者训练、进行重复计数或使用具有较低检测极限的方法来降低可变性,但所有这些解决方法都带来了增加的训练或处理时间的成本。另一个缺陷是卵损失率。样品中特定百分比的卵保持包裹在粪便残渣中并且没有使其进入漂浮步骤。根据技术和操作者,发现卵损失率在30至60%之间变化(Vidyashankar等,2012)。重要地,检测极限,通过给定技术课检测的最低卵计数,给已知的方法****了限制。其通常在1-50个卵/克(EPG)的范围内。McMaster技术(参见图1)通常具有25至50EPG的检测极限,使其非常难以检测低的卵计数水平,这对于抗性测试特别重要(Vidyashankar等,2012)。

因此,用抗蠕虫药的预防性治疗已经变成工业中的标准。不幸地,并且与抗生素的过度用药类似,正在上升的抗药性线虫的频率是所有物种中渐增的全球关注问题,特别是小的反刍动物(Kaplan,2004;Wolstenholme等,2004;Sutherland和Leathwick,2011;Jackson和Coop,2000;Roepstorff等,1987;Coles等,2003;Cernanska等,2006;Kornele等,2014)。兽医和管理机构目前都正式地认为这是快速增长的问题并且已经发布了指导来(1)帮助****这样的抗性的增长,和(2)尝试通过降低目前的处方和非处方抗蠕虫药的无差别使用来限制其(Wood等,1995;EMEA,2006;FDA,2014)。

不幸地,通过观察粪便卵计数降低(FECR)的针对抗性产生的****涉及使用卵漂浮方法,具有上述的缺陷8。因此,这些方法不可能被广泛使用。为了强调这种推测,最近的肯塔基州纯种农场调查显示出大部分调查对象认识到并且关注抗药性寄生虫现象;然而,超过70%的仍然是预防性地驱虫(Robert等,2014)。此外,来自USDA的研究已经显示出50-70%的牛农场主同意内寄生虫对其操作具有显著的经济影响(USDA,2011b);然而,仅有0.7%针对这个问题利用任何类型的实验室测试(USDA,2010)。总之,粪便卵计数的不便利性似乎代表了广泛采用针对性更强的方法来处理和控制寄生虫感染的显著障碍。

尽管欧洲的管理部门已经认识到抗药性菌株出现的****并开始限制其可利用性,但在****,这些药物中的许多目前仍然是作为非处方药开放给公众。因此,兽医专业协会已经推荐使用粪便卵计数降低测试(FECR)。FECR依赖于系统地评价寄生虫负荷,使用卵计数作为用抗蠕虫药治疗前后的寄生虫负荷的替代标记。可以通过治疗后卵计数的低于预期的下降来检测抗药性的产生,促进适当控制的响应来减少抗性菌株通过群体的增殖。因此,粪便卵计数变得越来越重要,尽管在提高这种临床上重要的诊断工具中获得了令人惊讶地非常小的进步。

尽管几乎过了一个世纪以及其他领域中精密复杂的现代化分析方法的发展,卵计数的实施保持相对不变,大部分的创新限于漂浮介质中的改进或从较大粪便样品收集卵的方法。例如,扩大了漂浮室的体积来提高灵敏度14,15,18,或已经研发了可替换的漂浮溶液14,17。

一些工作者已经使用如聚合酶链反应(Demeler等,2013;Learmount等,2009)和流式细胞术(Colditz等,2002)这样的方法,努力研发更精密复杂的尝试来检测或定量粪便中的卵。然而,这样精密复杂的技术,是昂贵的并且进行所述技术需要设备,因此对于作为除了研究目的以外的其他目的的工具,使其更不实际。

尽管一些努力已经针对发现卵表面探针来帮助检测,但这些努力限于筛选各种凝集素,以确定这些凝集素可以结合的卵的种。一旦确定,这些蛋白质可以用作种特****标记,用于检测(但不能定量)某些种或属的存在(Palmer和McCombe,1996;Hillrichs等,2012;Colditz等,2002)。然而,因为总的卵计数仍然是用于作出临床决定和用于****抗蠕虫药抗性的标准,因此仍然要鉴定所有蠕虫卵通用的标记。这样普遍存在并且在实验上已处理的标记的鉴定将打开利用其来研发计数总粪便卵载量的快速定量方法的可能性,并且因此取代漂浮方法及其相关的缺点。

不幸地,进行了很少的工作来阐明临床上相关的卵表面的组成,并且所进行的很少工作产生了很少具体的信息(Wharton,1983;Quiles等,2006)。

寄生原虫感染还引起各种医学和兽医学上重要的疾病,范围从人类中的疟疾和间质性浆细胞肺炎到鸟类、鱼和哺乳动物中的各种球虫病。许多疾病对宿主是致命的并且引起畜牧业中相当大的经济损失。球虫病是影响包括牛、绵羊、山羊、兔子、猪、鸡、火鸡、猫和狗的动物肠道的原生动物寄生虫病。感兴趣的寄生虫包括,但不限于,等孢球虫(Isospora sp.)(狗和猫);巨型艾美球虫(Eimeria maxima)、堆型艾美球虫(E.acervulina)、布氏艾美球虫(E.brunetti)、毒害艾美球虫(E.necatrix)和柔嫩艾美球虫(E.tenella)(鸡);珠鸡艾美球虫(E.meleagridis)、E.gallopavonis、E.adenoeides和分散艾美球虫(E.dispersa)(火鸡);牛艾美球虫(E.bovis)(牛);绵羊艾美球虫(E.ovina)(绵羊);猪艾美球虫(E.porci)(猪)和斯氏艾美球虫(E.stiedai)(兔子)。球虫病是许多牲畜种中经济上最重要的疾病之一。该疾病的特征在于腹泻、瘦弱、失去食欲和体重以及不同水平的死亡率。在牲畜动物中,部分由于通过肠道壁的营养素的吸收障碍引起的增重降低引起了经济损失。此外,与蠕虫感染一样,现有技术对于检测原生动物卵囊依赖于费时的方法。

尽管许多寄生虫在胃肠道中度过其生命周期的一部分并在粪便中排出,但许多其他寄生虫感染宿主动物的膀胱和肾脏。Pearsonema plica和Dioctophyme renale是两种这样的已知感染狗的膀胱和肾脏的寄生虫。在尿样中检测出了两个属的卵。血吸虫病种可以感染尿道或肠,可以在动物的尿液或粪便中发现其卵。

如可以看到的,尽管已经研发了许多现代方法,但这些测试没有被广泛采用并且人工卵计数仍然是最广泛利用的和常用的****肠寄生虫感染(即,蠕虫和原生动物寄生虫感染)的方法。因此,需要一种简单、精确和划算的用于定量粪便中的寄生虫卵数量的方法,其可以由兽医在现场或由动物的主人自己来进行。

概述

本发明是基于使用N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNac)结合结构域(例如,GlcNac结合蛋白)及其片段用于检测环境样品(例如,粪便样品)中的蠕虫卵。“检测”是指鉴定待检测目标的存在、不存在或含量。本发明****了简单的现场测试,其允许兽医和动物的主人来诊断蠕虫寄生虫感染和/或寄生原生动物感染的水平,由此允许它们更适当地和有效地针对其特定需求制定治疗和预防策略。这种测试还可以用于更多控制的实验室情况。这个说明书列出了脱离显微镜的寄生虫卵计数的一般原则,这是他们烦恼了几乎一个世纪的问题,并且描述了使用现代生化技术实现这一目的的特****测定法。

本文中公开的方法给予了目前的卵计数方案更多改进,即,所述方法将能够(1)增加样品处理量和消除主观性,由此降低或消除这些变化来源;(2)任选消除了漂浮步骤,这至少部分地减轻了卵损失率的问题;和(3)通过过滤浓缩粪便样品,其很大程度上提高了灵敏度。此外,该技术能够使测试在现场快速进行,由此消除将粪便运送至实验室和在那里处理一次时间的时间-和不便利-成本。最后,该技术能很好地适合已建立的兽医实践,因为总FEC(与寄生虫种无关)是最常用的告知临床治疗决定的度量标准(Coles等,2006;Nielsen等,2010)。

因此,在一个方面中,本发明****了用于检测环境样品中(例如,粪便样品、尿样、水样、废水或污水样品或土壤样品中)存在或不存在蠕虫卵和/或原生动物卵囊的方法。在一些方面中,本发明****了用于检测环境样品中存在或不存在蠕虫卵和/或原生动物卵囊的方法,该方法包括获得包含悬浮于样品缓冲液中的环境样品的溶液,使粪便溶液流过两个或更多个(例如,两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、二十个或五十个)孔径递减的滤器,数量和孔径由从其获得粪便的动物物种和待检测的卵和/或卵囊的类型来决定。

在一些方面中,本发明****了用于检测粪便样品中存在或不存在蠕虫卵和/或原生动物卵囊的方法,该方法包括获得包含悬浮于样品缓冲液中的粪便样品的粪便溶液,使粪便溶液流过两个或更多个(例如,两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、二十个或五十个)孔径递减的滤器,数量和孔径由从其获得粪便的动物物种和待检测的卵和/或卵囊的类型来决定。

如本文中使用的,术语“一个或多个”和“至少一个”可互换使用并且表示一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、二十个、五十个等“一个或多个”或“至少一个”所指的项目。术语“两个或更多个”表示至少两个,更合适地,两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、二十个、五十个等“两个或更多个”所指的项目。

因此,在一个方面中,使包含环境样品的溶液(例如,包含粪便样品的粪便溶液)流过具有约85微米至约350微米,约100微米至约300微米,约125微米至约250微米,或约150微米至约200微米孔径的第一滤膜,形成第一滤液,使第一滤液流过具有约1至约10微米,5微米至约45微米,约10微米至约45微米,约15微米至约45微米,约20微米至约45微米,约25微米至约40微米,或约30微米至约35微米孔径的第二滤膜,使第二滤膜上捕获的蠕虫卵接触与可检测部分缀合的N-乙酰基-D-葡糖胺结合结构域或其片段,如,例如,凝集素、几丁质酶、几丁质结合结构域(CBD)或其他N-乙酰基-D-葡糖胺结合蛋白或其片段,以及基于可检测部分,例如,可检测部分的****强度,检测粪便样品中存在或不存在蠕虫卵。

如本说明书中使用的术语“第一”、“第二”和“第三”只是以其相对含义。将理解,除非另外指出,使用那些术语仅作为一个或多个实施方案描述中方便的情况。术语“第一”、“第二”和“第三”仅用于区分一个元件与另一个元件,并且所公开技术的权利范围不应当受到这些术语的限制。例如,第一元件可以指定为第二元件,并且相似地,第二元件可以指定为第一元件。

在另一个方面中,本发明****了用于检测环境样品(例如,粪便样品)中存在或不存在蠕虫卵和/或原生动物卵囊的方法,包括获得包含悬浮于样品缓冲液中的环境样品的溶液(例如,包含粪便样品的粪便溶液),使粪便溶液流过具有约85微米至约350微米,约100微米至约300微米,约125微米至约250微米,或约150微米至约200微米孔径的第一滤膜,形成第一滤液,使第一滤液流过具有约1至约10微米,5微米至约45微米,约10微米至约45微米,约15微米至约45微米,约20微米至约45微米,约25微米至约40微米,或约30微米至约35微米孔径的第二滤膜,使第二滤膜上捕获的样品接触包含在荧光激发光下发出荧光的几丁质结合染料的第一种试剂,用荧光激发光照射第二滤膜上捕获的样品;并且基于荧光强度或荧光颗粒的数量检查样品的荧光,以确定样品中存在或不存在蠕虫卵和/或原生动物卵囊。

在再另一个方面中,本发明****了用于检测环境样品(例如,粪便样品)中存在或不存在蠕虫卵和/或原生动物卵囊的方法,包括获得包含悬浮于样品缓冲液中的环境样品的溶液(例如,包含粪便样品的粪便溶液),使粪便溶液流过具有约85微米至约350微米,约100微米至约300微米,约125微米至约250微米,或约150微米至约200微米孔径的第一滤膜,形成第一滤液,使第一滤液流过具有约1至约10微米,5微米至约45微米,约10微米至约45微米,约15微米至约45微米,约20微米至约45微米,约25微米至约40微米,或约30微米至约35微米孔径的第二滤膜,使第二滤膜上捕获的蠕虫卵和/或原生动物卵囊接触包含凝集素或CBD或N-乙酰基-D-葡糖胺结合蛋白或其片段的第一种试剂,形成第一种试剂样品,将第一种试剂样品接触包含特****地结合凝集素或CBD的抗体的第二种试剂,其中抗体与可检测部分缀合,并且基于可检测部分,确定样品中存在或不存在蠕虫卵和/或原生动物卵囊。

在一些实施方案中,环境样品是粪便样品。获得粪便溶液的步骤可以包括将粪便样品悬浮于样品缓冲液中,形成第一粪便溶液,并使第一粪便溶液流过具有约400微米至约800微米,约425微米至约750微米,约450微米至约700微米,约500微米至约650微米,或约550微米至约600微米孔径的整批滤膜,以****粪便溶液。在一个实施方案中,整批滤膜具有约400微米至约450微米的孔径,第一滤膜具有约85微米至约120微米的孔径和第二滤膜具有约20微米至约40微米的孔径。第一粪便溶液流过整批滤膜用来从其除去较大的颗粒和残渣,使得更有效地滤过第一和第二滤膜。

在一些实施方案中,该方法进一步包括使溶液流过第二滤膜后,将第二滤膜上捕获的蠕虫卵和/或原生动物卵囊悬浮于液体样品缓冲液中。

根据再一个方面,本文中公开的方法进一步包括在接触步骤前,用氧化剂或漂白液处理样品(例如,环境样品)。因此,在一些实施方案中,接触步骤前,用漂白液处理样品。

在一些实施方案中,GlcNac结合结构域是选自凝集素、几丁质酶或几丁质结合结构域(CBD),或其片段的GlcNac结合蛋白。更特别地,凝集素可以是能够结合N-乙酰基-D-葡糖胺的任何凝集素,包括,选自麦胚凝集素(WGA)、大豆凝集素(SBA)、桑橙(Maclura pomifera)凝集素(MPL)、红花紫荆凝集素(BPL)、曼陀罗凝集素(DSL)、番茄凝集素(LEL)、马铃薯凝集素(STL)和四棱豆-II(PTL-II)的凝集素。在一个实施方案中,凝集素是麦胚凝集素(WGA)。

在一些实施方案中,GlcNac结合蛋白与固体支持物,如磁性或非磁性珠子,或与膜,如硝基纤维素或聚偏氟乙烯缀合,所述膜可以用于捕获和浓缩卵,结合或替代过滤。

在一些实施方案中,GlcNac结合蛋白与选自半抗原、酶、抗体表位、抗原、荧光团、放射性同位素、****颗粒、结合对的成员和金属螯合物的可检测部分缀合。例如,可检测标记可以是结合对的第一成员,其中结合对选自生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、生物素/captavidin、表位/抗体、蛋白A/免疫球蛋白、蛋白G/免疫球蛋白、蛋白L/免疫球蛋白、GST/谷胱甘肽、His-标记物/金属(例如,镍、钴或铜)、抗原/抗体、FLAG/M1抗体、麦芽糖结合蛋白/麦芽糖、钙调蛋白结合蛋白/钙调蛋白、酶-酶底物和受体-配体结合对。在一个实施方案中,可检测部分是结合对的第一成员。在一些实施方案中,结合对的第一成员与N-乙酰基-D-葡糖胺结合蛋白缀合,而结合对的第二成员固定于固体支持物上。

在一些实施方案中,可检测部分是结合对的第一成员;并且结合对的第二成员与酶、抗体表位、抗原、荧光团、放射性同位素、****颗粒、第二结合对的成员和金属螯合物缀合。

在再另一个实施方案中,可检测部分是结合对的第一成员,其中结合对的第一成员是生物素和结合对的第二成员选自链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和capravidin,并且结合对的第二成员与酶缀合。

在一些实施方案中,可检测部分是选自绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素、5-异硫氰酸荧光素(FITC)、花青染料(Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7)、Bodipy染料(Invitrogen)和/或Alexa Fluor染料(Invitrogen)、丹酰、丹酰氯(DNS-C1)、5-(碘代乙酰胺)荧光素(5-IAF)、6-丙烯酰-2-二甲基氨基萘(acrylodan)、7-硝基苯并-2-氧-1,3-重氮-4-基氯化物(NBD-Cl)、溴化乙锭、萤虫黄、罗丹明染料(5-羧基罗丹明6G氢氯化物、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明-B-异硫氰酸酯(RITC(罗丹明-B-异硫氰酸酯)、罗丹明800);四甲基罗丹明5-(和6-)异硫氰酸酯(TRITC))、Texas红TM、磺酰氯、萘亚甲基胺磺酸(包括但不限于1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)和6-(对-甲苯氨基)萘-2-磺酸(TNS))、蒽羰基脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、荧光素-磷脂酰乙醇胺、Texas红-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷脂酰胆碱、芴基-磷脂酰胆碱、部花青540、萘苯乙烯、3,3'二丙基硫杂二羰菁(diS-C3-(5))、4-(对-二戊基氨基苯乙烯基)-l-甲基吡啶(二-5-ASP)、Cy-3碘乙酰胺、Cy-5-N-羟基琥珀酰亚胺、Cy-7-异硫氰酸酯、IR-125、噻唑橙、天青B、尼罗蓝、铝酞菁、噁嗪1,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst33342、TOTO、吖啶橙、乙锭均二聚物、N(乙氧基羰基甲基)-6-甲氧基喹啉(MQAE)、Fura-2、钙绿、羧基SNARF-6、BAPTA、香豆素、phytofiuors和晕苯。

在一些实施方案中,可检测部分是催化颜色变化的酶,包括选自碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶、脲酶和β-内酰胺酶和葡萄糖氧化酶的酶。

在一些实施方案中,GlcNac结合蛋白是麦胚凝集素和可检测部分是荧光素。

可以使用本领域技术人员已知的仪器和设备来测量可检测标记的****强度,包括,例如,便携式或台式荧光计(例如,手持荧光计)或便携式或桌式比色计(例如,手持比色计)。可以通过目视检查来确定可检测部分的****强度。在一些实施方案中,使用适用于观察选定的可检测部分的成像装置来测定可检测部分的****强度。在一些实施方案中,成像装置是数码相机、移动电话、智能电话、便携式计算机、计算机或****仪。

在一些实施方案中,该方法进一步包括对粪便样品中的蠕虫卵进行计数。在一个实施方案中,该方法包括使用显微镜进行粪便样品中蠕虫卵的计数。

在一些实施方案中,使第二滤膜上捕获的样品接触包含几丁质结合染料的第一试剂,所述染料在荧光激发光下发出荧光,其中在荧光激发光下发出荧光的几丁质结合染料选自calcofluor white、Uvitex 3B(联苯乙烯联苯荧光增白剂)、Rylux BA、Rylux BSU(1,4-苯二磺酸-2,2'-[亚乙基二基双[(3-磺基-4,1-亚苯)亚氨基[6-双(2-羟乙基)氨基]-1,3,5-三六钠盐)(Ostacolor,Pardubice,Czech Republic)和Blankophor(4,4'-双{(4-苯胺基)-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)氨基}二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠)。

在一些实施方案中,本发明公开内容****了用于检测环境样品中存在或不存在蠕虫卵或原生动物卵囊的方法,该方法包括获得包含悬浮于样品缓冲液中的环境样品的溶液,使溶液流过具有约85微米至约350微米孔径的第一滤膜,形成第一滤液;使第一滤液流过具有约5微米至约45微米孔径的第二滤膜;使第二滤膜上捕获的蠕虫卵接触与可检测部分缀合的N-乙酰基-D-葡糖胺结合蛋白或其片段;和基于可检测部分的****强度检测环境样品中存在或不存在蠕虫卵或原生动物卵囊。

在一些实施方案中,本发明公开内容****了用于检测环境样品中存在或不存在蠕虫卵或原生动物卵囊的方法,该方法包括:获得包含悬浮于样品缓冲液中的环境样品的溶液,使溶液流过具有约85微米至约350微米孔径的第一滤膜,形成第一滤液;使第一滤液流过具有约5微米至约45微米孔径的第二滤膜;使第二滤膜上捕获的样品接触包含在荧光激发光下发出荧光的几丁质结合染料的第一种试剂;用荧光激发光照射通过第二滤膜捕获的样品;和基于荧光强度或荧光颗粒的数量分析样品的荧光,以确定环境样品中存在或不存在蠕虫卵或原生动物卵囊。

在一些实施方案中,本发明公开内容****了用于检测环境样品中存在或不存在蠕虫卵或原生动物卵囊的方法,该方法包括:获得包含悬浮于样品缓冲液中的环境样品的溶液,使溶液流过具有约85微米至约350微米孔径的第一滤膜,形成第一滤液;使第一滤液流过具有约5微米至约45微米孔径的第二滤膜;使第二滤膜上捕获的蠕虫卵接触包含N-乙酰基-D-葡糖胺结合蛋白或其片段的第一种试剂,形成第一种试剂样品;使第一种试剂样品接触包含特****地结合N-乙酰基-D-葡糖胺结合蛋白的抗体的第二种试剂,其中抗体与可检测部分缀合;和基于可检测部分的强度确定粪便样品中存在或不存在蠕虫卵或原生动物卵囊。

在一些实施方案中,环境样品是粪便样品。因此,获得溶液包括将粪便样品悬浮于样品缓冲液中,形成第一粪便溶液;以及使第一粪便溶液流过具有约400微米至约800微米孔径的整批滤膜,获得包含粪便样品的溶液。

除非另外限定,本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文中描述的方法和材料用于本发明中;也可以使用其他合适的本领域已知的方法和材料。材料、方法和实施例只是说明性的而没有打算用来限制。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、****库条目和其他参考文献将其全部并入作为参考。在冲突的情况中,将以本发明的说明书为准,包括定义。

从以下的详述和附图,以及从权利要求,将清楚本发明的其他特征和优势。

附图描述

专利或申请文件含有至少一幅有颜色的图。此具有彩色附图的专利或专利申请公开的拷贝一经请求并支付必要的费用将由专利局****。

图1是示意图,显示了根据本发明的使用用于卵捕获的磁珠检测粪便样品中存在或不存在蠕虫卵的方法。

图2是示意图,显示了根据本发明的使用多步骤过滤方法检测粪便样品中存在或不存在蠕虫卵的方法。

图3A至3D是****,显示了漂白前后的样品(图A=未漂白的;图B=漂白4分钟后的样品;图C=漂白6分钟后的样品;和图D=漂白8分钟后的样品)。

图4显示了用FITC标记的麦胚凝集素(WGA)获得的几丁质特****蠕虫卵染色。

图5A至5J显示了用缀合荧光素的CBD的蠕虫卵的染色。(以相衬(A-E)或荧光模式(F-J)使样品成像)。条=200微米。

图6证明了通过缀合荧光素的CBD染色的来自牛粪便的各种蠕虫卵和原生动物卵囊。条=200微米。

图7证明了卵阳性和卵阴性粪便中卵的比色检测。

图8A和8B证明了来自马粪便的CBD染色的卵的成像。在相衬(A)和荧光模式(B)中在40×放大倍数下产生了McMaster网格的合成图像。插页显示了包括真菌孢子(箭头)的代表性区域的放大。条=1.5mm。

图9A-9D显示了CBD-荧光素染色的卵的图像。用8MP iPhone 5s(A、B)或16MP Olympus PE2 Pen相机(C、D)将卵成像。图像原始显示(A,C)或处理除去背景后显示(B、D)。条(A)=1mm,条(B)=0.5mm。

图10显示了用Olympus消费者级别相机和****相机成像的自动化计数的传统McMaster计数的校正。在每种情况的四个独立测试中评价了三个粪便样品并且将结果平均。

图11显示了通常自动化测试呈现出低于传统McMaster方法的可变性。显示了带有标准偏差的来自图10的结果(n=4)。

图12显示了用于捕获根据图1或2中所述的方法制备的样品的图像的测试仪器的顶等距视图。

图13显示了图12装置的底视图。

图14显示了具有连接的样品室的图12装置的底等距视图。

图15显示了图14中显示的装置和样品室的一部分的横截面。

详述

以下公开内容描述了用于检测环境样品中(例如,粪便样品、尿样、水样、废水或污水样品或土壤样品中)存在或不存在蠕虫卵和/或原生动物卵囊的新方法。为了易于审查,****了用于检测粪便样品中存在或不存在蠕虫卵和/或原生动物卵囊的示例性方法和试剂盒,用于说明性的目的并且不是用来限制本发明的范围,其由所附权利要求的范围来限定。

尽管几丁质已经被描述为一些蠕虫卵和原生动物卵囊的组分,但一般从不知道其是这些卵的通用组分。至少一部分,本发明是基于发明人以下的发现:几丁质可以作为大部分(如果不是全部)蠕虫寄生虫卵(参见,例如,图5)和/或原生动物卵囊的通用标记并且因此形成测定总寄生虫载量的测试的基础。几丁质是结构上与纤维素相似的线性聚合物,但全部由β1-4连接的N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)单体组成,而不是葡萄糖(Rudall和Kenchington,1973)。除了纤维素,其是自然界中最大量的生物聚合物,陆地和水生节肢动物的外骨骼的主要成分以及真菌和(较少程度的)酵母的细胞壁的关键组分。几丁质作为生物基质的结构组分的通用作用和大部分蠕虫卵的表面的相似出现,表明其可以是用于寄生虫卵的普遍标记。

几丁质的存在不仅可以用各种识别凝集素和各种小分子荧光团的GlcNAc来半特****地探测,而且可以使用由其各自的几丁质结合结构域(CBD)组成的各种几丁质酶的平截形式来更严格地探测(Hardt和Laine,2004;Hashimoto等,2000;Gao等,2002;Arakane等,2003;Chu等,2001;Kolbe等,1998;Zeltins和Schrempf,1995)。因此,发明人假设可以(1)通过比色,通过将酶报道分子连接于GlcNAc结合蛋白,在添加合适底物时产生****;或(2)通过荧光,通过将GlcNAc结合蛋白与合适的荧光团缀合来完成来自粪便样品的蠕虫卵的检测。

尽管CBD和凝集素对几丁质和含有糖结构的GlcNAc呈现出较高的结合亲和力,但它们也可以结合其他碳水化合物聚合物,特别是纤维素,其是食草动物和杂食动物粪便的主要成分。文献中可用的****是变化的并且有时候是矛盾的26-30,使得不清楚这样的蛋白质是否能够区分卵和大量剩余的粪便。发明人已经发现这样的蛋白质确实可以用于在这个背景材料上检测卵并且因此形成对其进行计数的方法的基础。

本文中****了用于检测环境样品中存在或不存在蠕虫寄生虫卵或原生动物卵囊的方法和相关硬件。值得注意的是,本文中****的方法利用了过滤方法,包括使环境样品流过具有约85微米至约350微米,约100微米至约300微米,约125微米至约250微米,或约150微米至约200微米孔径的第一滤膜,形成第一滤液;使第一滤液流过具有约1至约10微米,5微米至约45微米,约10微米至约45微米,约15微米至约45微米,约20微米至约45微米,约25微米至约40微米,或约30微米至约35微米孔径的第二滤膜;使第二滤膜上捕获的蠕虫卵和原生动物卵囊接触结合几丁质或N-乙酰基-D-葡糖胺的试剂;并通过定量或定性地观察结合几丁质或N-乙酰基-D-葡糖胺的试剂结合环境样品中的蠕虫卵或原生动物卵囊的程度来检测环境样品中存在或不存在蠕虫卵或原生动物卵囊。环境样品可以是任何怀疑含有蠕虫卵或原生动物卵囊的样品,包括,例如,粪便样品、水样、废水或污水样品或土壤样品。

本发明公开内容还****了用于对样品中的蠕虫寄生虫卵和/或原生动物卵囊进行计数的方法和相关硬件。所公开的方法远离了使用显微镜的卵计数方法,其中所述使用显微镜的方法困扰了一个世纪或更长时间,并且所公开的方法描述了使用现代生化技术的特定方法。

可以通过两步法,卵捕获和卵检测,在动物粪便在水或其他合适的液体(包括缓冲液)中的悬浮液中检测卵。在一个步骤中,作为将其与粪便残渣分离的方式,将卵捕获在固体基质上。基质可以是二维或三维的,并且自身可以以例如珠子或颗粒的形式共同悬浮于液体中。

通过用如可以与卵表面相互作用的蛋白质、碳水化合物或激活的化学基团这样的分子覆盖基质来促进卵捕获。如果需要,可以通过用化学品预处理粪便悬浮液来暴露或激活卵上可以促进捕获的化学基团,从而促进捕获。这样的化学品包括,但不限于,漂白剂、表面活性剂、氧化剂、促溶剂和酶。

捕获可以是特****的,使用作为非限制性实例的对抗只识别所有寄生虫卵或某些分类群或特定种的寄生虫卵上的卵成分(例如,GlcNac)或凝集素的抗体。或者,捕获可以是非特****的,并且****了一种从颗粒粪便残渣但不一定是所有粪便组分中分离卵的方式。作为非限制性实例,在交联剂,如碳二亚胺、醛等的存在下,通过化学反应基团,如N-乙基-马来酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、胺来实现这种捕获。或者,可以通过识别寄生虫卵,并且识别粪便的其他成分的大分子,如蛋白质或碳水化合物来实现这种捕获。

基质上的捕获不需要依赖于特定的化学品来结合卵并且也可以通过物理方法来实现,例如,过滤,其中可以通过过滤(作为非限制性实例,100微米滤器)将卵与大的粪便颗粒分离。然后使含有卵的滤液通过较小的滤器(例如,10-40微米μm)来捕获卵,同时除去较小的颗粒,包括孢子和真菌(如果检测剂也可以结合这些细胞,其可能影响卵的检测)。然后可以按照别处所述的检测和定量滤器上捕获的卵。或者,可以不使用固体基质,从粪便捕获和分离卵。例如,可以通过慢速离心除去大的粪便颗粒,并且通过较快旋转(其无论如何太慢以致不能沉淀较小颗粒和酵母或真菌)从上清液收获卵。其他物理方法,如扩散、电泳、色谱或密度分离,也可以用于在检测前分离卵。

卵检测的方法取决于捕获是特****的还是非特****的。如果捕获步骤是特****的,那么检测方法的选择就不太严格,因为已经除去了杂质粪便成分(例如,使用覆盖了CBD的磁珠捕获卵,并且随后使用结合几丁质和其他糖聚合物(如纤维素)的用于检测的荧光染料,例如,cacofluor白)。如果捕获是非特****的或半特****的,并且还捕获了非卵成分,那么检测必须足够特****来区分卵和杂质。可能的非限制性检测方法包括:目视检查;连接并随后光学检测卵自身特****的分子,如抗体、几丁质结合结构域、凝集素或其他蛋白质,所有都缀合合适的报道分子,如荧光团、发色团、酶、有色微粒、量子点或胶体金属。用于检测一般细胞组分的化学方法也可以使用,并且这些包括是用本领域技术人员已知的测试检测蛋白质、碳水化合物、脂质和****的方法。另外,从卵中释放后,也可以使用卵DNA或RNA与特****探针的杂交,或这样的****通过PCR的扩增。物理方法也可以用于****检测中的特****(如果需要,在卵从基质释放后),并且这样的方法的非限制性实例包括离心、过滤、漂浮或颗粒计数(例如,使用如库尔特计数器、细胞分选器或粒径分析仪这样的设备)。在一些情况中,其中基质是颗粒或珠子的形式,可以通过珠子/颗粒自身的检测来间接地检测卵。用于这个目的的珠子/颗 ,梢匀窝∮煤鲜实姆⑸呕蛴馔爬幢昙牵源俳觳狻>萘私舛杂诒疚募哪康模逃铩凹觳馐约痢卑ㄊ迪旨觳庑枰乃凶榉帧@纾山岷厦傅目固遄槌傻募觳饧烈哺荻ㄒ褰徊桨ê鲜实拿傅孜铩⒒撼寮梁褪迪旨觳庑枰难丈浠枰钠渌约痢

可以使用仍然结合固体基质的卵来实现检测,或卵从基质释放后进行检测,并且检测试剂的结合可以在捕获前或捕获后进行。在一些情况中,可以通过用化学品处理卵来暴露或释放可以被检测到的成分,从而促进检测。这样的化学品的非限制性实例包括表面活性剂、氧化剂、螯合剂和酶。

通过选择合适的捕获试剂和检测试剂,卵计数可以将检测样品中的所有卵或来自整个门的不同分类群的卵转向物种水平。这可以通过使用单种用于捕获和检测的试剂,或通过在捕获和检测步骤之一或两者中使用多种试剂来实现。通过从不同的种类/物种分离卵,并且缀合合适的试剂,可以在单个测试中分解各种类别或物种的寄生虫卵的丰度。

还可以通过加入能够结合卵的多价分子,在溶液中诱导卵聚集,来促进卵的捕获。絮凝的卵可以从粪便悬浮液直接结合基质或通过物理技术(如离心或漂浮)的分离后结合。

捕获和检测还可以同时进行,例如,通过检测卵结合已经连接碳-****纤维网络的卵特****抗体时的电压变化,或通过光学方法,如表面等离子体共振或折射。

在一种情况中,可以在没有卵的捕获的情况下来实现检测,其中通过荧光团各向****或偏振的变化来检测用荧光团标记的卵特****分子(如抗体或凝集素)。

因此,在一些方面中,本发明公开内容****了用于检测环境样品(例如,粪便样品)中存在或不存在含几丁质的寄生虫蠕虫卵或原生动物卵囊的新方法。本文中公开的方法****了可以快速并在现场进行的方法。更重要地,本文中公开的方法能够检测以快速、成本效益的方式检测来自寄生虫蠕虫的主要分类群(例如,绦虫、线虫、吸虫和单殖吸虫)的每一个的蠕虫卵。感染动物的蠕虫寄生虫的常见属包括,例如,血矛线虫属(Haemonchus)、毛圆线虫属(Trichostrongylus)、胃线虫属(Ostertagia)、细颈线虫属(Nematodirus)、古柏线虫属(Cooperia)、蛔虫属(Ascaris)、仰口线虫属(Bunostomum)、结节线虫属(Oesophagostomum)、夏氏线虫属(Chabertia)、鞭虫属(Trichuris)、圆线虫属(Strongylus)、毛线属(Trichonema)、网尾线虫属(Dictyocaulus)、毛细线虫属(Capillaria)、Pearsonema、异刺线虫属(Heterakis)、弓蛔虫属(Toxocara)、Ascardia、尖尾线虫属(Oxyuris)、Ancyclostoma、钩虫属(Uncinaria)、弓蛔线虫属(Toxascaris)和Parascaris Ancylostoma、板口线虫属(Necator)、旋毛虫属(Trichinella)、毛细线虫属(Capillaria)、膨结线虫属(Dioctophyme)、艾美虫属(Eimeria)、球虫属(Coccidia)、伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus)、胃线虫属(Ostertagia)、长刺线虫属(Mecistocirrus)、Trychostrongylus、鞭虫属(Trichuris)、Bunostoinuin、Oesophagostomurn、夏氏线虫属(Chabertia)、夏氏线虫属(Chabertia)、钩口线虫属(Ancylostoma)、并殖线虫属(Paragonimus)、贝利蛔线虫属(Baylisascaris)、滑刃线虫属(Aphelenchoides)、根结线虫属(Meliodogyne)、异皮线虫属(Heterodera)、球异皮线虫属(Globodera)、Nacobbus、短体线虫属(Pratylenchus)、茎线虫属(Ditylenchus)、剑线虫属(Xiphinema)、Longidorus、轮胎虫属(Trichodorus)、细颈线虫属(Nematodirus)和蛲虫属(Enterobius)。

本发明的方法可以用于人和/或兽医使用以及用于环境测试领域中。

在一个方面中,本发明的方法****了从哺乳动物(例如,动物或人受试者)获得包括粪便样品(例如,大便样品)的生物样品。例如,粪便样品可以获自马、奶牛、猪、山羊、绵羊、美洲鸵、鹿、狗、猫、鸟或人的哺乳动物粪便样品。“获得”意思是收集、购买或另外获取粪便样品。

在一些方面中,本文中公开的新方法包括使怀疑含有蠕虫卵或原生动物卵囊的样品接触GlcNAc结合结构域或其片段。如本文中使用的术语“N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNac)结合结构域”是指包括天然或遗传修饰的N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNac)结合蛋白、对N-乙酰基-D-葡糖胺具有特****的结合亲和力的无机分子和有机分子,包括其任何片段、衍生物或类似物。

如本文中使用的术语“N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNac)结合蛋白”是指对N-乙酰基-D-葡糖胺具有特****的结合亲和力的任何分子,包括天然或遗传修饰的蛋白质、肽或抗体,包括其任何片段、衍生物或类似物。示例性GlcNac结合蛋白包括,例如,凝集素、几丁质酶、几丁质结合蛋白或几丁质结合结构域(CBD)。

在一些实施方案中,本文中公开的新方法包括使怀疑含有蠕虫卵或原生动物卵囊的样品接触几丁质结合蛋白或其片段。如本文中使用的术语“几丁质结合蛋白”是指对几丁质具有特****的结合亲和力的任何分子,包括天然或遗传修饰的蛋白质、肽、抗体。几丁质结合蛋白包括,例如,N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNac)结合蛋白、几丁质酶和蛋白质几丁质结合结构域(CBD)。

如本文中使用的术语“凝集素”是指与糖类(即,碳水化合物)特****地相互作用的任何分子,包括蛋白质,天然或遗传修饰的。尽管本文中的实施例涉及天然植物凝集素,但本文中的术语“凝集素”是指来自任何物种的具有所需碳水化合物结合特****的凝集素,所述物种包括但不限于,植物、动物、昆虫和微生物。植物凝集素的实例包括,但不限于,豆科凝集素家族,如ConA,大豆凝集素和小扁豆凝集素。植物凝集素的其他实例是凝集素的稻科和茄科家族。动物凝集素的实例包括,但不限于,主要群体S-型凝集素、C-型凝集素、对-型凝集素和I-型凝集素的任何已知凝集素。

在一些实施方案中,凝集素选自麦胚凝集素(WGA)、大豆凝集素(SBA)、桑橙凝集素(MPL)、红花紫荆凝集素(BPL)、曼陀罗凝集素(DSL)、番茄凝集素(LEL)、马铃薯凝集素(STL)和四棱豆-II(PTL-II)。

如本文中使用的术语“几丁质结合结构域”或“CBD”是指与几丁质特****地相互作用的任何分子,包括蛋白质,天然或遗传修饰的。CBD是本领域技术人员已知的并且可以源自几丁质酶或源自节肢动物的表皮蛋白,并且在商业上可以从多个来源购得,包括由New England Biolabs供应的IMPACTTM试剂盒。

术语“几丁质酶”通常描述底物几丁质特****的酶。许多不同类型的几丁质酶是天然产生的。例如,几丁质酶可以在微生物中找到,如沙雷氏均属(Serratia)、弧菌属(Vibrio)和链霉菌属(Streptomyces)。

本发明公开内容****了与一个或多个可检测部分缀合的N-乙酰基-D-葡糖胺结合结构域,包括N-乙酰基-D-葡糖胺结合蛋白。如本文中使用的,术语“标记”和“可检测部分”可互换并且应当是指可以连接于(例如,缀合于)结合蛋白以由此使得结合蛋白可以通过仪器或方法来检测的部分。

适用于所公开发明实施中的可检测部分的非限制性实例包括,例如,半抗原、酶、发色团、抗体表位、抗原、荧光团、反射性同位素、****颗粒、结合对的成员、发光化合物和金属螯合物。

如本文中使用的,术语“荧光标记”和“荧光团”可互换使用并且是指底物被不同波长(激发波长)照射时在某一个波长(发射波长)下发射电磁能量的任何物质,并且打算包括能够与样品中的目标分析物特****地相互作用或反应的化学或生化分子或其片段,以****一个或多个光学****。

用于本文中****的方法中的代表性荧光团包括,例如,绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素、5-异硫氰酸荧光素(FITC)、花青染料(Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7)、Bodipy染料(Invitrogen)和/或Alexa Fluor染料(Invitrogen)、丹酰、丹酰氯(DNS-C1)、5-(碘代乙酰胺)荧光素(5-IAF)、6-丙烯酰-2-二甲基氨基萘(acrylodan)、7-硝基苯并-2-氧-1,3-重氮-4-基氯化物(NBD-Cl)、溴化乙锭、萤虫黄、罗丹明染料(5-羧基罗丹明6G氢氯化物、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明-B-异硫氰酸酯(RITC(罗丹明-B-异硫氰酸酯)、罗丹明800);四甲基罗丹明5-(和6-)异硫氰酸酯(TRITC))、Texas红TM、磺酰氯、萘亚甲基胺磺酸(包括但不限于1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS)和6-(对-甲苯氨基)萘-2-磺酸(TNS))、蒽羰基脂肪酸、DPH、十八碳四烯酸、TMA-DPH、芴基脂肪酸、荧光素-磷脂酰乙醇胺、Texas红-磷脂酰乙醇胺、芘基-磷脂酰胆碱、芴基-磷脂酰胆碱、部花青540、萘苯乙烯、3,3'二丙基硫杂二羰菁(diS-C3-(5))、4-(对-二戊基氨基苯乙烯基)-l-甲基吡啶(二-5-ASP)、Cy-3碘乙酰胺、Cy-5-N-羟基琥珀酰亚胺、Cy-7-异硫氰酸酯、IR-125、噻唑橙、天青B、尼罗蓝、铝酞菁、噁嗪1,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、Hoechst 33342、TOTO、吖啶橙、乙锭均二聚物、N(乙氧基羰基甲基)-6-甲氧基喹啉(MQAE)、Fura-2、钙绿、羧基SNARF-6、BAPTA、香豆素、phytofiuors、晕苯和金属-配体复合物。

用于本文中****的方法中的半抗原包括,例如,******、谷胱甘肽和生物素。

用于本文中****的方法中的酶包括,例如,碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶(HRP)、大豆过氧化物酶(SBP)、脲酶、β-内酰胺酶和葡萄糖氧化酶。

在一些实施方案中,GlcNac结合蛋白是抗体。抗几丁质(例如,抗-GlcNac抗体)已经公开于US5004699中,那些抗体可以用于检测真菌和酵母(US5004699)。

可检测部分可以是结合对的特定成员(第一成员或第二成员)。用于本文中****的方法中的结合对包括,例如,生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/抗生物素蛋白、生物素/中性抗生物素蛋白、生物素/captavidin、表位/抗体、蛋白A/免疫球蛋白、蛋白G/免疫球蛋白、蛋白L/免疫球蛋白、GST/谷胱甘肽、His-标记物/金属(例如,镍、钴或铜)、抗原/抗体、FLAG/M1抗体、麦芽糖结合蛋白/麦芽糖、钙调蛋白结合蛋白/钙调蛋白、酶-酶底物和受体-配体结合对。在一些实施方案中,GlcNac结合蛋白与结合对的第一成员(例如,生物素、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、captavid、抗体、抗原、蛋白A、蛋白G、蛋白L、GST、His-Tag、FLAG、MBP、钙调蛋白结合蛋白、酶、受体或配体)。

在一个实施方案中,GlcNac结合蛋白是麦胚凝集素且可检测部分是荧光素。在另一个实施方案中,GlcNac结合蛋白是含有几丁质结合结构域的蛋白且可检测部分是荧光素。

在一些方面中,本文中****的方法使用直接结合几丁质的染料,并且暴露于荧光激发光时发出荧光,如U.S.6,440,388中公开的染料。结合或缀合几丁质并且在紫外光或可见光中发出荧光的染料的非限制性实例包括calcofluor白、Uvitex 3B(联苯乙烯联苯荧光增白剂)、Rylux BA、Rylux BSU(1,4-苯二磺酸-2,2'-[亚乙基二基双[(3-磺基-4,1-亚苯)亚氨基[6-双(2-羟乙基)氨基]-1,3,5-三六钠盐)(Ostacolor,Pardubice,Czech Republic)和Blankophor(4,4'-双{(4-苯胺基)-6-吗啉代-1,3,5-三嗪-2-基)氨基}二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠)。

在一些实施方案中,结合对的第一成员与GlcNac结合蛋白缀合且结合对的第二成员固定于固体支持物上。在其他实施方案中,结合对的第一成员与GlcNac结合蛋白缀合且结合对的第二成员与酶、抗体表位、抗原、荧光团、放射性同位素、****颗粒、第二结合对的成员和金属螯合物缀合。例如,结合对的第一成员可以是生物素,而结合对的第二成员可以是链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或capravidin,而结合对的第二成员与酶(例如,碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化酶(HRP)、脲酶、大豆过氧化物酶(SBP)、β-内酰胺酶或葡萄糖氧化酶)缀合。

在一些情况中,几丁质(例如,GlcNac)可以被多糖荚膜或蠕虫卵中发现的其他类型的大分子包衣部分或全部地阻隔。然而,几丁质是非常强壮的,因此,在几丁质检测前,可以使用蛋白酶或多糖(如,葡聚糖酶或甘露聚糖酶)的酶消化可以用于渗透或除去阻隔层。或者,可以使用极端处理,如在漂白溶液(1%NaOCl、0.5M NaOH,或具有或高或低浓度的单独化学品的相似组合物),如US2007/0099234中所述的)中漂白来除去遮盖层。因此,在一些实施方案中,本文中****的方法进一步包括,在使蠕虫卵接触GlcNac结合蛋白之前,用漂白剂或其他外壳暴露溶液处理样品的步骤。

根据本文中****的方法,可以通过两步法:卵捕获和卵检测,在水或其他的合适液体(包括缓冲液)中的动物粪便的悬浮液中检测寄生虫卵。

在一些方面中,本文中所述的方法包括通过过滤捕获卵,该方法包括****包含悬浮于样品缓冲液中的粪便样品的粪便溶液,使粪便溶液流过第一滤膜,形成第一滤液,并使第一滤液流过第二滤膜,以在第二滤膜上捕获蠕虫卵。

在一个方面中,该方法包括获得包含悬浮于样品缓冲液中的粪便样品的粪便溶液,使粪便溶液流过第一滤膜,形成第一滤液,并使第一滤液流过第二滤膜,其中蠕虫卵捕获在第二滤膜上。该方法进一步包括使第二滤膜上捕获的蠕虫卵接触与可检测部分缀合的GlcNac结合蛋白,并且基于可检测部分的****强度来检测粪便样品中存在或不存在蠕虫卵。

在一个方面中,本文中****的方法包括使粪便溶液流过第一滤膜(例如,过滤器)。使粪便溶液流过第一滤膜允许将卵与粪便颗粒分离。因此,第一滤膜包含允许卵****通过过滤器的孔径(例如,具有至少80微米的孔径)并且还捕获粪便颗粒。

因此,本文中****的方法包括使用第一过滤装置。通常选择第一过滤装置的孔径,使得孔足够大,允许蠕虫卵和原生动物卵囊****通过,同时足够小,以从粪便溶液捕获细颗粒(例如,小于约450微米,小于约425微米,或小于约400微米)。在一些实施方案中,第一过滤装置的第一滤膜包含约85微米至约350微米,约100微米至约300微米,约125微米至约250微米,约150微米至约200微米,或约85微米,约90微米,约95微米,约100微米,约120微米,约125微米,约150微米,约175微米,约200微米,约250微米,约300微米,约350微米或至多约400微米的孔径。

在一个方面中,本文中****的方法包括使粪便溶液流过第二滤膜(例如,过滤器)。因此,第二滤膜包含允许流体****通过过滤器并且还捕获卵或卵囊的孔径(例如,具有80微米或更小的孔径)。

因此,本文中****的方法包括使用第二过滤装置。通常选择第二过滤装置的孔径,使得孔足够大,允许流体和细颗粒****通过,同时是限定大小的(即,足够小),以从粪便溶液捕获蠕虫卵。寄生虫蠕虫卵的特征性大小和直径为约20微米至80微米。因此,为了从粪便溶液捕获蠕虫卵,第二过滤装置的第二滤膜包含约5至约45微米,10至约45微米,15至约45微米,约20微米至约45微米,约25微米至约40微米,约30微米至约35微米,或约5微米,约10微米,约15微米,约20微米,约25微米,约30微米,约35微米,约40微米,或约45微米的孔径。因为许多原生动物卵囊比蠕虫卵小,还可以使用更小的孔过滤器,例如,约0.1至约10微米或约5至约20微米。

粪便样品中的无关粪便残渣的最少化对于一致的粪便卵计数是有益的,并且通常,必须在粪便适于接触GlcNac结合蛋白之前,从粪便样品中滤掉大的颗粒。因此,本文中公开的方法任选包括使用整批过滤装置来除去较大的颗粒和残渣。通常选择整批过滤装置的孔径,使得孔足够大,允许蠕虫卵和原生动物卵囊****通过,同时足够小,以从粪便材料捕获大的颗粒(例如,大于或等于400微米的颗粒)和残渣。例如,整批过滤装置的滤膜包含约400微米至约800微米,约425微米至约750微米,约450微米至约700微米,约500微米至约650微米,或约550微米至约600微米的孔径。在一些实施方案中,整批过滤装置可以直接连接用于收集粪便样品的容器(例如,收集容器)。在一些实施方案中,整批过滤装置具有约400微米至约450微米的孔径,第二滤膜具有约85微米至约120微米的孔径,和第二滤膜具有约20微米至约30微米的孔径。

如本领域已知的,存在许多方式使一定体积的液体(例如,溶液)流滤膜,如重力流动、压力或借助泵。

本发明的方法通过用合适的报道分子(例如,可检测部分)标记几丁质,使得可以观察含几丁质的寄生虫虫卵和原生动物卵囊。通过合适的报道分子(例如,可检测部分)结合几丁质后,可以(1)通过与色**比较,通过使用廉价的单波长比色计或荧光计,或使用照相机、****、平板电脑或其他数字成像装置拍照后通过数字化定量颜色,或(2)在荧光几丁质-结合衍生物的情况中,通过在使用配备了合适光学的****或其他照相机的合适照射下,结合自动化成像系统,将样品成像,从而通过观察完成卵的定量。

用形成可检测光响应的光波长照射可检测部分,并且用检测光响应的装置观察。照射时,如通过紫外或可见波长照射,荧光化合物,包括结合GlcNac结合蛋白或特****结合对成员的那些,呈现强烈的可见吸收以及荧光发射。用于照射本发明的荧光化合物的选定设备包括,但不限于,有利地,用于照射荧光化合物的设备包括便携式照射灯(例如,手持式紫外照射灯)。这些照射源任选整合至便携式激光****仪、荧光微平板阅读器、荧光凝胶成像仪、标准或迷你荧光计、标准或迷你比色计或色谱检测器。在检测之前,通过经由防止一些或全部激发光通过的光滤波器,减少或除去过量的激发光。这种荧光发射任选通过目视检查来检测,或通过使用以下的任一种成像装置来检测:光学相机、移动电话、智能电话、平板电脑、便携式计算机、计算机和****仪。

本发明还****了用于检测粪便样品中存在或不存在蠕虫卵和原生动物卵囊的试剂盒。本发明的试剂盒可以采用各种形式。通常,试剂盒将包括适用于检测样品中的蠕虫卵的试剂。任选地,试剂盒可以含有一种或多种对照样品。

本发明的试剂盒任选包含收集容器,其中可以放置一定量的粪便样品并通过合适的缓冲液稀释。然后可以将容器密封并且将粪便样品和缓冲液振荡或均质,以产生均匀混合的粪便溶液。缓冲液可以是普通自来水或合适的缓冲或漂浮介质。收集容器可以是用于粪便收集的******容器或可再使用的容器。

收集容器可以是例如常规加盖试管的形式,具有刻度,其表明放置在试管内部的原始大便样本的体积,以及待加入的稀释液体的量。

在一些实施方案中,收集容器连接整批过滤装置。

试剂盒还可以包含用于收集粪便样品的构造,如用于大便收集的******容器等,以及挖取设备,例如,小勺形状的,以挑取确定量的粪便材料。挖取设备(勺)可以是容器盖的整体部分。

在一些实施方案中,如本文中所述的,本发明的试剂盒包含第一过滤装置,任选第二过滤装置和任选整批过滤装置。

本发明的试剂盒包含含有GlcNAc结合蛋白的试剂(例如,试剂溶液)。GlcNac结合蛋白可以是如本文中所述的凝集素或CBD。任选地,GlcNac结合蛋白与可检测部分缀合。在一个实施方案中,试剂含有能够直接结合或缀合于几丁质并且暴露于光时发射荧光的染料,以及发射能够从结合几丁质的染料发射荧光的波长的光源。

试剂盒可以包括用于检测可检测部分的便携式系统,如荧光计、比色计、分光光度计或其他成像装置。试剂盒还可以包括设计用于支撑样品和检测可检测部分的便携式系统的支架。在一些实施方案中,试剂盒包含支撑或含有成像装置的支架。

试剂盒的一些部分(例如,检测装置或过滤系统的可重复使用的部分)可以与试剂盒的其他部分(单次使用的过滤器 ,榈募觳馐约)分开****。

本发明的试剂盒可以用于人和/或兽医使用。

以上列出的一般原则可以用于设计大量用于检测粪便悬浮液中的寄生虫卵的存在和丰度的系统。为了说明的目的,以下是使用这些原则可以产生的几种卵计数测定法的一些非限制性实例。****这些实施例只是用于说明许多其中可以实施本发明的不同模式中的一些的目的,而不应当被认为是对整个发明的描述。

应当注意的是寄生虫卵的成功检测和定量需要从整批的粪便样品分离(和理想地浓缩)卵的方法,以及随后检测所述卵的方法。如果分离方法还导致可能的其他粪便成分的共同分离,并且检测方法不能区分,则该测定法将不是特****的。例如,Zhang和McReynold23公开了使用来自各种几丁质酶的几丁质结合结构域(CBD)检测生物样品中的几丁质,用于诊断目的。然而,由于许多生物体,例如,酵母、其他真菌、线虫(及其卵)全部含有几丁质,因此仅仅检测几丁质不能被认为是这些生物体中的任一种的确凿诊断。相似地,Winters24公开了使用抗几丁质抗体来检测生物样品中的几丁质,作为用于诊断酵母和真菌存在的方法。然而,Winters没有预见检测蠕虫或其卵中的几丁质的可能性,并且因此所公开的测定法不能被认为对于酵母或真菌是特****的,也不能被认为对于蠕虫或其卵是特****的,除非可以排除存在这些组之一的可能性。在动物粪便(并且特别是针对食草动物)的情况中,酵母和真菌细胞(和孢子)以及昆虫片段的存在是可能的,并且因此单独的几丁质存在不能明确地认为是寄生虫卵存在的诊断,在其他含几丁质生物体的潜在变化背景的存在下,寄生虫卵的定量也不可能认为是可靠的。

还提出了各种凝集素可以用于区分不同物种的寄生虫及其卵。然而,公知大部分凝集素是半特****的,因为它们识别可以存在于各种生物体中的糖结构。因此,尽管凝集素结合可以区分反应性和非反应性物种,但作为一般原则,单独的凝集素结合不能****寄生虫感染的确凿诊断,除非所有其他可能的污染生物体已经显示出是结合阴性的。

在一些实施方案中,将粪便样品悬浮于水或合适的缓冲液,如但不限于,磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,并接触覆盖了能够结合寄生虫卵的试剂(例如,GlcNac结合蛋白)的珠子。试剂可以只是这些卵特****的,或是目标分类群的卵特****的,或是卵和粪便的其他成分都特****的。特****试剂包括,例如,针对特定的目标生物体产生的或识别多个生物体群的单****抗体,或针对多个群或单个生物体产生的多****抗体,或多个单****抗体和/或多****抗体的混合物。非特****试剂包括蛋白质,如CBD或凝集素或其混合物,单独的或与抗体组合。在CBD的情况中,可以通过在高于7的升高pH下和/或在高盐浓度下(例如,但不限于0.5M NaCl)应用CBD来增强结合。对于本发明的目的,据了解CBD不仅是指来自任何物种的单个几丁质结合结构域,而且是指通过化学缀合或通过另两个具有或没有非CBD间插序列的CBD的串联重复的遗传融合的表达产生的多个CBD。还据了解CBD不必须是自然界中发现的天然序列,而且还可以是能够结合几丁质的人工肽序列,或CBD的突变变体,其与天然序列相比具有相同或不同的结合亲和力。

在另一个实施方案中,缓冲液还可以任选含有有助于暴露卵上所需目标结合位点的试剂,并且包括,但不限于,表面活性剂(如Tween-20、十二烷基硫酸钠和Triton X-100)、氧化剂(如次氯酸钠、N-氯甲苯磺酰基酰胺或过氧化氢)、促溶剂(如脲或盐酸胍)、酶(如蛋白酶、糖苷酶或脂酶)或漂白剂。

结合时,将加载了卵(和可能的其他粪便成分)的珠子与粪便的剩余部分通过物理分离,例如,通过过滤(使用具有足以截留珠子及其负载物但不截留其他粪便残渣的孔径的过滤器),或通过离心。或者,珠子可以用铁包埋,并且可以通过施加磁场,将这样的顺磁性或磁性珠子(其可以容易地在商业上购得)与粪便悬浮液的剩余部分分离。

珠子分离时,将珠子悬浮于小体积(例如100μl)缓冲液中并且使用显微镜通过光学检查。尽管这种方法没有免去目视检查的不便利性,但其允许从粪便分离和计数大量的卵。现有的方法只取样几克粪便样品的1/25至1/200,导致低灵敏度和高可变性。这种方法通过消除这样的子取样消除了这两个问题。

在一个方面中,如图1中所绘,按照实施例1中所述的,使用磁珠分离卵。在一个实施方案中,附着于珠子上的捕获试剂是CBD,其通过6个组氨酸残基的序列在其N-或C-端可逆地附着于磁珠上,所述组氨酸残基序列结合到珠子表面上的镍原子上。在另一个实施方案中,CBD与载体,如麦芽糖结合蛋白(MBP)融合,其用于可逆地使CBD附着于覆盖了麦芽糖的珠子上。在这些实施方案中,可以通过添加作为非限制性实例的组氨酸、咪唑或麦芽糖,使CBD脱离珠子。

在分离卵和除去粪便残渣时,通过添加合适的洗脱剂(例如,组氨酸(或咪唑)或麦芽糖的溶液),从珠子释放结合的材料。然后将珠子再次附着于磁铁上并且使含有释放的卵和粪便材料的溶液通过过滤器。这个步骤的目的是将也可以结合CBD的真菌和酵母细胞与卵分离。选择过滤器的孔径,使得允许较小(5-40μm)的酵母和真菌细胞通过,同时截留较大的卵细胞(50-100μm),由此****在这样的系统中单独的CBD没有****的特****。吸出溶液时,只有卵(带有结合的CBD)和珠子(其通过磁铁粘附到试管的侧面)保留在测试室中。

由于溶液的吸出除去了洗脱分子(例如,组氨酸(或咪唑)或麦芽糖),所以添加新鲜的缓冲液和除去磁铁允许卵通过附着的CBD再次结合珠子。由于珠子因其铁含量是棕色的,所以在除去未结合卵的珠子后,珠子自身可以用于定量存在的卵的数量。由于珠子自身比卵小得多(商业上可购得的珠子大小范围为0.2至5微米),所以通过第二次经过相同的过滤器来除去未结合的珠子(尽管也可以使用不同的试管和新鲜的过滤器)。

然后将截留的、卵结合的珠子重新悬浮于新鲜缓冲液中并且通过将悬浮液导入检测室中来定量。室的基部含有将卵-珠子复合物吸引至小的表面积中的小磁铁。这个检测室的目的是浓缩卵/珠子复合物,以鉴别珠子颜色并允许与标准化色**相比来视觉测定颜色强度,从而定量样品中存在的珠子的数量(并因此定量卵的数量)。或者,可以通过光学传感器将该区域成像,以获得更准确的颜色强度的读出。

任选使用分光光度计或单波长比色计来测量卵/珠子悬浮液的浊度,从而通过光学测定珠子的数量(并且因此测定卵的数量)。

在一些实施方案中,通过测量其散射光的能力,在最初从珠子释放时,对卵进行定量。酵母和真菌,如果存在,可以通过选择合适的用于检测的光的波长,或通过使用粒径分析仪,基于其较小的大小,与卵区分开来。

在其他实施方案中,捕获试剂不必须是CBD,并且作为非限制性实例,可以是抗体(单****或多****的)或凝集素(或凝集素的混合物)。

在另一个实施方案中,若捕获试剂只对寄生虫卵是特****的,或只对临床感兴趣的卵的子集是特****的,则只使用一个吸出步骤(没有使用洗脱剂)来除去未结合的珠子并且随后如上所述帮助卵/珠子复合物的定量。

在再另一个实施方案中,如果捕获试剂还结合酵母和/或真菌并且如果结合珠子的酵母和/或真菌细胞没有形成足够大的以被过滤器(其孔径足够小,以截留卵/珠子聚集物/复合物)截留的聚集物或复合物,或如果酵母和/或真菌载荷没有在该测试中产生临床上有意义的背景,那么只使用一个吸出步骤(没有使用洗脱剂)来除去未结合的珠子和酵母/真菌(如果存在)并且随后如上所述帮助卵/珠子复合物的定量。

在另一个实施方案中,通过利用作为非限制性实例的蛋白质测定法、碳水化合物测定法的显色反应,或通过使其他识别分子,如抗体、凝集素或CBD附着于卵上来实现结合的卵的检测。在后一种情况中,将分子与报告基团缀合,所述报告基团如发色团、荧光团、有色微珠、量子点、胶态金属或显色酶(例如,HRP或AP)。

在另一个实施方案中,并且在卵特****捕获的情况中,可以使用如别处详述的那些方法捕获卵并洗涤珠子后立即进行检测,并且不需要过滤步骤。

在另一个实施方案中,在卵特****捕获的情况中,可以使用颗粒计数装置,如库尔特计数器、细胞分选器或粒径分析仪,进行卵的检测,使用或未用从珠子的释放。

在本发明的再另一个实施方案中,用试剂处理卵/珠子复合物,以释放用于化学检测的成分。这样的试剂包括,但不限于,蛋白酶、糖苷酶(包括几丁质酶)、表面活性剂、促溶剂和氧化剂。

本文中公开的方法允许在现场由兽医或由动物的主人自身定量粪便卵载荷,因为不需要昂贵的、专门化的设备或训练(磁铁、珠子、单波长比色计全部可以廉价制造并且不需要专门化的训练来操作)。

在一个方面中,本文中公开的方法包括使用结合到固体表面上的捕获试剂(如抗体、凝集素或CBD),所述固体表面如二维条状材料,尽管实际形状可以按照需要而改变。条带可以由任何相容的材料组成,所述材料包括但不限于,塑料(如聚乙烯、聚丙烯或聚苯乙烯)或其他聚合物(如纤维素、磷酸纤维素或聚偏二氟乙烯)。可以通过本领域技术人员可利用的许多反应性化学品之一并根据表面化学的性质,使捕获试剂结合到表面上。能够使蛋白质结合到这样表面上的可能的、非限制性分子包括辛二酸二琥珀酰亚胺酯、己二亚氨二甲酯、琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺。捕获试剂不需要施用于整个表面并且可以定位于特定区域,如点或条带。

在另一个实施方案中,捕获试剂以上述方式可逆地附着于表面上。

然后将表面接触粪便悬浮液,以允许卵结合并随后洗涤除去粪便杂质。然后将条带接触含有检测试剂的溶液。检测试剂可以再次是与合适的报道分子缀合的能够结合卵的任一种分子,包括抗体、凝集素或CBD。报道分子需要能够在表面上产生可见****并且包括发色团、荧光团、酶、胶态金属、量子点或有色微粒。在酶的情况中,将表面洗涤并随后接触合适的底物,其产物必须是不溶的,以便沉积在表面上,用于观察。此类系统的两个非限制性实例为:酶是辣根过氧化物酶,且底物是4-氯-1-萘酚或3,3’-二氨基联苯胺,或酶是碱性磷酸酶,且底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐和硝基四氮唑蓝。

颜色沉积时,其与基底上捕获的卵的数量成比例,通过与校准的色**的视觉比较或通过使用如比色计或密度计这样的装置来定量卵的数量。

在本发明的另一个实施方案中,使用底物进行了固定的卵的酶检测,底物的可溶性有色产物释放至溶液中,以产生随后可以通过光学检测的颜色变化。

在本发明的另一个实施方案中,并且在其中捕获试剂可逆地结合到表面上的情况中,结合和洗涤后释放卵/捕获试剂,并随后在溶液中检测。

如在其他实施方案中,任选在任一阶段通过以上已经公开的试剂来处理卵,以暴露位点或释放检测分子,所述位点或检测分子是捕获或检测所必需的。

在一些方面中,本文中公开的方法采用用于例如消费者家庭怀孕测试中的相似形式的侧流格式。将含有样品室的装置的一端放入溶液中,或将溶液的样品分配至设备的室中。所述室含有检测剂,如,但不限于,与如有色微粒、量子点或胶态金属这样的检测剂缀合的抗体、凝集素或CBD。

进入室时,样品(包括现在结合检测试剂的卵)在固体基质(如纸或其他烧结的聚合物)上通过毛细管作用形成条带。将此条带的一部分用与上述那些相似的捕获试剂覆盖,允许将卵和相关的有色检测试剂固定。

通过卵/试剂复合物的粘附在覆盖了捕获试剂的条带区域上产生颜色是粪便中存在的卵的数量的诊断。可以通过与校准的色**比较,或通过使用电荷耦合装置或相似装置将颜色成像接着进行合适的****处理,目测确定数量。

为了最大化卵的捕获,理想地捕获试剂是卵最特****的,同时检测试剂可以是识别力较低的,尽管反过来也是可以的。如在别处所述的其他实施方案中,针对捕获和检测试剂的主要标准是与其两者的结合对除了寄生虫卵或寄生虫卵的子集以外的所有粪便组分是互斥的。

如在其他实施方案中,可以任选通过以上已经公开的试剂处理卵,以暴露位点或释放分子,所述位点或分子是捕获或检测所必需的。

在一些实施方案中,条带含有两个或更多个被各自对不同物种的分类群具有特****的捕获试剂覆盖的区域。在这种情况中,许多相当于不同种类寄生虫卵的数量的色区出现。

在另一个实施方案中,样品室包含多种检测试剂,每种可识别来自不同物种或分类群的卵。然后将标记的卵捕获在单个区域中并且通过将该区域成像并随后通过计算将每种有色试剂的相对贡献(并且因此重建卵类型/数量)重建成待检测的最终颜色来测定每种类型的卵的量。

在施用装置之前或施用于装置之前,可以将检测试剂与粪便悬浮液直接混合,并且因此没有存储在装置的样品室中。

如在其他实施方案中,可以任选在任一个阶段通过以上已经公开的试剂处理卵,以暴露位点或释放分子,所述位点或分子是捕获或检测所必需的。

在一些方面中,所述方法包括用其自身使用上述方法固定在****表面上的合适捕获试剂来捕获卵。****表面可以采用任何容器的形式,包括,但不限于,试管、比色皿、含有一个或多个孔的盘或板。

在希望除去粪便残渣时,加入以以上所述的一种或多种方式标记的检测试剂。目测结合的检测试剂的颜色(或通过检测试剂的酶活性产生的颜色)并与校准的色**进行比较,或通过使用如比色计、微平板读出器、分光光度计或荧光计这样的装置来测量。

在本发明的另一个方面中,不存在检测试剂并且通过测量卵结合时****表面的折射率的变化,或通过其他光学方法,如表面等离子体共振或折射法来确定卵的结合。

如在其他实施方案中,可以任选在任一个阶段通过以上已经公开的试剂处理卵,以暴露位点或释放分子,所述位点或分子是捕获或检测所需的。

在这个实施方案中,并且为了说明的目的,其实例描绘于图2中,使用物理方法-即过滤,捕获卵并与酵母和真菌分离。将卵在合适的容器中均质并随后通过具有有助于卵通过的孔径(例如,约85微米至约350微米)的第一滤膜。还可以选择孔径来除去较大的粪便残渣,并因此帮助澄清样品并因此降低在该方法之后的步骤中阻塞过滤器的可能性。

然后将滤液放入第二容器中并且通过第二滤膜,其孔径足够小以截留蠕虫卵(例如,约20微米至约45微米),但允许较小的颗粒通过和去除,包括酵母和真菌细胞。

在本发明的另一个实施方案中,使样品通过多个过滤器或按序减小的孔径,以逐渐除去较大的颗粒,同时在到达截留卵的最后一个过滤器前截留卵。

通过过滤器捕获卵时,加入卵结合/检测试剂,以结合卵。结合试剂可以包括,但不限于,GlcNac结合蛋白(例如,抗体、凝集素或CBD)。检测试剂可以包括,但不限于,酶、发色团、荧光团、有色微球体或****球体、量子点或胶态金属。结合试剂可以与捕获试剂直接化学耦合,形成单分子实体(例如,使用本领域公知的蛋白交联化学的卵特****抗体或CBD与酶的化学耦合,如辣根过氧化酶),或可以通过非共价(例如,静电或疏水性)相互作用来结合。在本发明的一个实施方案中,结合试剂包括His6标记物并且检测试剂含有连接的金属,如镍、铜或钴,以促进相互作用。如果结合试剂和检测试剂不是共价结合的,那么在加入卵样品之前,将其预先混合来促进其相互作用,可以分开添加,以允许它们在卵的存在下发生相互作用。

在酶检测试剂的情况中,酶可以任选作为结合试剂和酶两者的****融合体来产生,以形成单个分子实体。一个非限制性实例可以是CBD与碱性磷酸酶****的融合子,以产生可以结合并用于检测卵的CBD-AP融合蛋白。在这样的情况中,可以制得编码多个结合结构域(包括相同结构域或多个不同结构域的重复片段)和多个酶结构域(包括相同结构域或多个不同结构域的重复片段)的构建体,以调节试剂的结合亲和力和检测灵敏度。

用检测试剂孵育时,将样品再次过滤,以除去未结合的试剂,同时截留卵,并且任选洗涤,以确保未结合试剂的完全去除。

然后可以在原位定量卵的数量,或从容器中取出卵/试剂混合物后定量。在发色团、荧光团和其他可以直接通过光学定量的检测试剂的情况中,在检测前,首先使用例如酸、碱、促溶剂、表面活性剂或盐,将其从珠子洗脱。这样的释放后,在检测前,任选可以通过过滤,将试剂与卵分离。

在酶检测系统的情况中,表示存在卵的数量的有色反应产物可以是可溶或不溶的。在可溶性产物的情况中,可以在容器中原位测定其光学强度,或从容器中取出后,或过滤除去卵和任何残余的粪便颗粒后,进行测定。可以通过测量悬浮液的浊度相似地检测不溶性产物,或可以另外通过其孔径足够小以截留产物的膜,接着对过滤器的表面进行光学检测。

实施例

在以下实施例中进一步描述了本发明,其没有限制权利要求中所述的本发明的范围。

以上列出的一般原则可以用于设计大量用于检测粪便悬浮液或环境样品中寄生虫卵和原生动物卵囊的存在或丰度的系统。为了说明的目的,以下列出了可以使用这些原则产生的几种卵计数测定法的各种非限制性实例。这些实施例只是****用于说明其中可以实施本发明的许多不同模式中的一些的目的而不应当被认为是对整个发明的描述。

实施例1

这个实施例研究了具有90微米和27微米孔径的Pluriselect过滤器(Pluriselect PluriCell Strainer)是否适用于a)过滤掉不需要的粪便残渣,和b)捕获和可能浓缩圆线虫卵。

首先使用McMaster方法估算马粪便样品的粪便卵计数。将五克粪便悬浮于45ml漂浮介质(37.5%葡萄糖/25%氯化钠)中。将悬浮液在具有内置筛网(大约0.5mm孔径)的Fill Flotac容器中混合。装满两个计数室(等于检测的1.0ml悬浮液)。这产生了每克10个卵(EPG)的倍增因数。

然后,使10ml漂浮介质悬浮液通过具有90微米孔径的第一过滤器过滤。McMaster的一个计数室(0.5ml)装满滤液,并检查卵的存在。这表示大约20EPG的倍增因数。

然后使流过样品通过具有27微米的第二过滤器。再一次,在McMaster室中检查0.5ml(大约20EPG的倍增因数)。将27微米过滤器上收集的材料重悬浮于1ml漂浮介质中并且加载于一个McMaster室(0.5ml)中,并计数。如果将滤液重悬浮于精确的0.5ml中,这里的倍增因数将为约2EPG。

表1

*约200μl悬浮液仍然在移液管中并且没有加载至室中,因此真实的卵产量毫无疑问更高-可能高于600EPG。

实施例2

将五克粪便悬浮于45ml漂浮介质中,形成粪便溶液。将悬浮液在具有内置筛网(大约0.5mm孔径)的Fill Flotac容器中混合。使10ml粪便溶液通过具有90微米孔径的第一过滤器(PluriselectCell Strainer)过滤。然后使流过样品通过具有27微米的第二过滤器(PluriselectCell Strainer),用于在27微米过滤器上的捕获。将材料在27μ过滤器表面上漂白(1%次氯酸盐溶液),然后回收。对未漂白的样品和漂白4、6和8分钟的样品捕获图像。图3A至3D是显示漂白前后的样品的****(图A=未漂白的;图B=漂白4分钟后的样品;图C=漂白6分钟后的样品;和图D=漂白8分钟后的样品)。在第一张图(图A)中,正常的未漂白的卵显示为深色椭圆形物体。在后面的图(图B-D)中,漂白的卵显示为半****的。其他显著和非预期的作用是显著减少了残渣,可能是由于纤维素氧化引起的,这进一步有助于光学测量。

实施例3

将五克粪便悬浮于45ml漂浮介质中,形成粪便溶液。将悬浮液在具有内置筛网(大约0.5mm孔径)的Fill Flotac容器中混合。使10ml粪便溶液通过具有90微米孔径的第一过滤器(PluriselectCell Strainer)过滤。然后使流过样品通过具有27微米的第二过滤器(PluriselectCell Strainer),用于在27微米过滤器上的捕获。将材料在27μ过滤器表面上漂白(1%次氯酸盐溶液)5分钟。然后使漂白的卵接触含有阻断剂(Carboblock,Vector labs)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中含有不同稀释度的麦胚凝集素-FITC(5mg/ml,Vector Labs)的试剂溶液(图4)。WGA孵育时间为15分钟。将卵悬浮液置于盖玻片下并通过荧光显微镜检查。

实施例4

通过将六个组氨酸残基****至pTXB1质粒(New England Biolabs)中来产生CBD。这产生了由N-末端His标记物接着是内含肽内切酶以及随后是C末端的环状芽孢杆菌(Bacillus ciruclans)的CBD的融合蛋白。这种蛋白在大肠杆菌中通过细胞质表达并且在镍螯合物柱上纯化。然后根据制造商的说明使用NHS-荧光素(Pierce)来标记CBD(使用PBS作为缀合缓冲液,在室温下持续60分钟)。脱盐后,这产生了6.7mg/ml CBD溶液,每个CBD具有1.5至2个荧光素分子。通过过滤、漂白处理粪便样品并用1:100稀释的荧光CBD染色,然后使用相衬(图5A-E)或荧光模式(图5F-J)在显微镜上成像。显示了含有来自成年马的圆线虫(A,F)、来自小马驹的蛔虫(B,G)和来自山羊的毛圆线虫(C,H)、来自奶牛的毛圆线虫和鞭虫卵(D,I)和来自猫的弓蛔虫卵(E,J)的样品。这证明了来自环状芽孢杆菌的CBD结合多个不同物种中的几个重要类别的寄生虫的卵。图6显示了来自图5中所示的牛样品(D和I)的各种圆线虫、鞭虫卵和球虫卵囊的叠化剪辑(montage)。来自这些完全不同的属的卵被染色的事实证明了几丁质作为用于多种蠕虫寄生虫卵和原生动物卵囊的通用标志物。此外,尽管存在大量来自粪便的无关粪便残渣,这些卵和卵囊被明确染色的事实证明了,尽管之前报道了与纤维素的交叉反应,CBD确实能够区分这些粪便成分。

实施例5

使马粪便浆液通过90微米过滤器(PluriselectCell Strainer),并且随后在27微米过滤器(PluriselectCell Strainer)上捕获,并用1%次氯酸盐漂白2分钟。用PBS洗涤后,使过滤器上的卵接触Carboblock/PBS中1:1000稀释的5mg/ml WGA-生物素缀合物(Vector Labs)15分钟。用PBS再次洗涤卵并随后接触Carboblock/PBS中1:500稀释的5mg/ml链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶缀合物(Vector Labs)15分钟。用PBS最终洗涤后,使卵接触100mM碳酸氢钠pH10中的5mM对-硝基苯酚磷酸盐溶液。在室温下7分钟后,将样品拍照并用分光光度计测量。

在这个实施例中,发明人区分了卵阳性马粪便(800个卵/克)和卵阴性粪便(图7)。WGA-AP的量显示出在测试的两个浓度下都饱和了,表明可以通过降低其浓度进一步提高信噪比。

实施例6

图8A和8B显示了在落射荧光显微镜上40×获取的马粪便的漂浮、CBD染色的卵的McMaster网格的20个图像的合成。按照实施例4中所述的,处理卵并用CBD染色。样品的检查显示出少量通过过滤未除去的真菌孢子的存在(图7B,插入箭头)。荧光图像简单数字处理除去背景后(水平和阈值滤波),发明人能够通过使用获自国立卫生研究院(National Institutes of Health)的开源免费软件Image J来定量卵的数量。该软件允许使用者通过大小和形状来分析颗粒,由此****计算方法来区分卵和孢子(其更小且更圆)。通过眼睛计数获得了104个卵计数和19个孢子,而Image J软件检测到107个卵和16个孢子。为了模拟将通过消费者级别的相机或****产生的图像,将图像从4800×4800像素缩减到1350×1350-等于使用整个McMaster室(不只是图像中的网格)填充8万像素传感器的较短****。在这种情况中,Image J软件计数了103个卵和20个孢子。这些****表明因此原则上可以将基于几丁质的标记结合这种成像方法来准确地计数粪便样品中的卵。

发明人进一步表明了可以使用消费者级别的相机(配备有微距镜头的Olympus E-PM2)和配备有微距镜头(Olliclip 7x)****(Apple iPhone 5s)来获取这样的图像(图9A-D)。用使用蓝色LED照明和廉价的橙色Perspex板作为发射滤波器的简单电泳凝胶荧光成像系统(PrepOne Sapphire,EmbiTec)来获取这些图像。这些****证明了用于观察荧光染色的卵的廉价成像系统的构建是可能的。

实施例7

发明人已经使用以上的成像系统证明了自动化卵计数与通过标准McMasters方法获得的计数直接相关。通过McMaster方法或通过实施例6中描述的方法(n=4)来定量三个马粪便样品并且用Olympus E-PM2和iPhone 5s来成像。McMasters计数相对于自动化计数的绘图显示出两种相机进行地同样好(图10)并且自动化计数与传统卵计数成比例。此外,尽管50%输入自动化测试中的卵在处理过程中丢失(斜率~0.5)的事实,但分析了十倍多粪便的事实表示自动化测试仍然比McMasters灵敏5倍。此外,在大部分情况中,如通过标准偏差评价的自动化方法的变化性仍然优于McMaster(图11)。

在一些方面中,可以使用便携式测试仪器结合数字相机或智能电话来实施本文中****的方法。非限制性实例的测试仪器100显示于图12-15中。测试仪器100包括支架110,其包括具有相机支架122的上表面120。支架110支撑具有光源132的测试电路板134、包括具有集成发射滤波器的镜头支架140的相机室130和具有容纳样品的检测室的测试支架150。如上所述,排列测试仪器100的元件,使得放置在相机支架122中的相机可以经由相机室130在光学上接近放置在测试支架150中的并通过用于图像捕获的光源132照射的样品。

如图12中所示,测试仪器100的各个元件可连接支架110。支架110具有通常是平的上表面和四个支撑腿112。支撑腿112将上表面升高离开桌子、工作台或其他工作表面。支撑腿112通过位于上表面120****的降低支架110重量并允许使用者操作测试仪器100的各个部分(例如,如图14和15中所示的测试支架150)的截口(cut-out)114分开。

上表面120具有通常放置在上表面120中间的大的矩形凹口或盲孔,相机支架122。相机支架122构造成与测试仪器100一起保持和排列便携式相机,如数码相机或具有照相能力的智能电话。相机支架122具有光学进口124,其允许智能电话的相机通过上表面120和从放置在上表面120****的测试支架150(如图14和15中所示的)检测照射。使用者使用位于上表面120一端的抓取口126来放置相机支架122中的智能电话。

参考图13,测试仪器100的底视图显示了固定于支架100的相机室130。在图13的底视图中,相机室130显示出围绕镜头支架140,光源132和一部分测试电路134。连接支架100底表面的是电路盖128。如在图15中可最佳看到的,电路盖128覆盖了测试电路板134,其放置在支架110底表面邻近。电路盖128将测试电路板134保持在合适位置并且与上面的智能电话和测试电路板134****的测试支架150在光学上成一直线。将电路盖通过螺旋轴套安装在支架110的底表面,所述螺旋轴套与盖在一直线上(未显示)。

光源132位于测试电路板134之中或之上。如以上所述,光源132可以是蓝色LED。LED 132排列在测试电路板134的底表面上,使得LED照射相机室130和以下的测试支架150中的样品。图12中显示了四个LED 132;然而,可以使用更多或更少的LED。例如,可以排列一个、两个或三个LED围绕镜头支架和集成发射滤光器140,或可以使用五个或更多个LED。

如图14中所示,测试支架150连接底部并且将测试支架150形成螺纹,使得含有新样品的测试支架150可以快速且容易地旋进测试仪器100上的位置中。还考虑了可以通过咬合(snap fitting)(一种快速释放机制)、磁耦合或任何本领域已知的能够耦合相机室130和测试支架150的其他合适装置,将相机室130和测试支架150在机械上耦合在一起。如上所述,测试支架150可以包括一个或多个用于分离和粘附样品中的卵的过滤器。样品中存在的卵可以结合测试支架150内的过滤器之一,并且在光学上可接近光源134和相机室130。

完全装配的测试仪器100显示于图15中。尽管没有显示,放置在相机支架122中的数码相机将具有经由连接上表面120的光学进口124的镜头和镜头支架140通过测试仪器100的通畅的光学进口。如上所述,测试电路板134的底表面上的光源132(图15中未显示)照射静置在测试支架150中下部的样品并且允许获取****。

在一些实施中,支架110优选由轻质材料制成,例如,模压或挤压塑料,或轻质金属,如铝。尽管图12-14中显示的实施包括四条腿112和四个截口114,但更多或更少的腿和截口是可能的。例如,支架110可以包括上表面120任一端由上表面120每侧的一个截口分开的两个宽的支撑腿。或者,支架110可以不包括腿,替代的是围绕上表面120周边的单个实体升高的支撑物,并且不含截口。其他实施也是可能的。

相机室130形成螺纹,以允许容易地连接测试支架150。在一些实施方案中,可以****室盖,其旋在相机室130上并且在样品和测试支架150不在适当位置时保护镜头和具有集成发射滤波器的镜头支架140以及测试电路板134。

在一些实施中,测试电路板134还可以支撑用于光源132的电源,例如,一个或多个电池。

其他实施方案

应当理解尽管已经结合其详述描述了本发明,但是之前的描述旨在用于说明本发明而不是限制本发明的范围,本发明是通过所附权利要求的范围来限定的。其他方面、优点和改变在以下权利要求的范围内。

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